Bromatologia

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4 METODOLOGIA

4.1 Linhagens celulares e tratamento
As linhagens celulares que serão utilizadas neste trabalho são os melanomas humanos metastáticos SK-Mel-19, SK-Mel-28, SK-Mel-103 doadas pela Profa. Dra. Silvya Stuchi Maria-Engler da Universidade de São Paulo. As células serão cultivadas em meio DMEM completo (10% Soro Bovino Fetal e antibióticos – Ampicilina 1% e Estreptomicina 1%) e incubadasem estufa a 37 ºC e 5 % de CO2.

4.2 Citotoxicidade pelo ensaio de Alamar Blue
O ensaio de Alamar Blue será realizado segundo metodologia descrita por Ahmed e colaboradores (1994). O Alamar Blue utiliza a resazurina de cor azul e não fluorescente, é reduzida a resofurin, de cor rosa e fluorescente, e não precipita após ser reduzida; porém o mecanismo pelo qual esse processo ocorre ainda não estábem esclarecido, o que pode ocorrer por reações enzimáticas ou químicas em células viáveis. O Alamar Blue é utilizado em ensaios de citotoxicidade, determinação da função mitocondrial, proliferação e viabilidade celular (BÉNÉRÉ, 2007).

4.3 Exclusão por Azul de Tripan
A viabilidade celular foi avaliada pelo ensaio de exclusão por corante Azul de Tripan 0,4% em PBS (FRESHNEY, 1987), no qual ascélulas foram consideradas não viáveis quando, ao se analisar por microscopia óptica, apresentaram a coloração azul em seu interior. Para a realização do ensaio, as células foram semeadas na densidade 1,5 X 104 células por poço em placas de 24 poços. Decorridas 24 h, o meio foi retirado e, então adicionou-se meio com diferentes concentrações do fármaco. A doxorrubicina será utilizada como controlepositivo e DMSO como controle negativo. Após o período de tratamento determinado (24/48/72 h) as células serão colhidas e centrifugadas a 3000 rpm por 5 minutos. O sobrenadante será dercartado e o pellet de células será ressuspendido com 90 µL de meio DMEM completo, aos quais serão adicionados 10 µL de Tripan Blue. Decorridos 2 minutos, 10 µL da suspensão de células será aplicado em uma câmara deNeubauer e serão contadas as células viáveis e as não-viáveis.

4.4 Teste do Cometa
O teste do cometa será realizado de acordo com a metodologia proposta por Singh (1988), com algumas modificações. Para o controle positivo será utilizado Doxorrubicina e para controle negativo, o diluente. Neste ensaio, as células são aplicadas em um gel de agarose sobre uma lâmina de microscópio e a seguir lisadas esubmetidas a um campo elétrico em tampão alcalino. A presença de quebras simples, sítios lábeis alcalinos e crosslinks resultantes da ação de compostos genotóxicos, altera a estrutura do DNA das células, que normalmente está superenrolado e fortemente compactado, causando relaxamento em partes da molécula que migram em direção ao anodo. Desta forma, após aplicação de corantes específicos, pode‐sevisualizar em microscópio de fluorescência a migração do DNA, que se assemelha a um cometa. A capacidade que o DNA tem de migrar é função tanto do tamanho da molécula como da quantidade de extremidades livres que, mesmo ligadas a segmentos maiores, migram numa distância pequena do corpo do cometa. O tamanho da cauda inicialmente aumenta proporcionalmente à quantidade de danos, mas a migraçãomáxima é determinada pelas condições da eletroforese, não o tamanho dos fragmentos. A intensidade da fluorescência na cauda em relação àquela do corpo do cometa fornece informações sobre a quantidade de quebras no DNA. Assim, pode‐se avaliar o dano genético tanto através da medida do comprimento da cauda do cometa, como através da quantidade de DNA presente, sendo ambos função das doses de exposição.4.5 Coloração Diferencial pelo Brometo de Etídeo (BE) / Acridina Orange (AO)
A indução de apoptose, originalmente descrita como uma morfologia peculiar de morte celular fisiológica ou programada (KERR et al, 1972), e de necrose, caracterizada como uma morte celular onde há perda precoce da integridade da membrana plasmática (SQUIER et al, 2001) será avaliada pela coloração diferencial de...
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