biotecnologia

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26/08/2014

Histórico

Biotecnologia Farmacêutica

1944 (Avery e colaboradores) – O DNA é o material genético.
1961 (Nieremberg) – Começa a decifrar o Código Genético.
1970 (Smith & Wilcox) – Descobrem as enzimas de restrição.

Aplicações do DNA

1974 (Cohen & Boyer) – Combinam DNA de um anfíbio com de
uma bactéria (E. coli), produzindo o primeiro ser com DNA
recombinante.
- Tendoinício a Engenharia Genética ou Tecnologia do DNA

recombinante.

Luciana de Souza Nunes

Histórico

Tecnologia do DNA Recombinante

1976 – Desenvolvida a primeira proteína humana numa bactéria
geneticamente modificada.
1982



Iniciou-se

a

comercialização

da

primeira

droga

O DNA tornou-se, a molécula mais fácil de ser
analisada, sendo possível isolar regiõesespecíficas,

recombinante, a insulina humana.

obtê-las em grande quantidade e determinar a sua

1982 – Desenvolvido primeiro animal transgênico (camundongo).

sequência

1983 – Desenvolvida primeira planta transgênica (Fumo).

nucleotídeos por dia.

numa

velocidade

de

milhares

de

1994 – Iniciou-se a comercialização do primeiro produto
transgênico (Tomate Flavr-Savr).Aplicação da Tecnologia do DNA
Recombinante

Aplicação da Tecnologia do DNA
Recombinante

Ela pode ser usada para estudar:
Sua aplicação comercial ou biotecnológica parece ter um



mecanismos de replicação e expressão gênica;



determinação da seqüência de um gene e conseqüentemente da

potencial inesgotável.
proteína que ele codifica;


desenvolvimento de culturasmicrobianas capazes de produzir
substâncias úteis tais como a insulina humana, hormônio de
crescimento,
quantidades.

vacinas

e

enzimas

industriais

em

grandes

Como conseqüência do desenvolvimento desta tecnologia é
atualmente possível realizar investigação de paternidade e o
diagnóstico de doenças genéticas e infecciosas através da análise
de DNA.

1

26/08/2014Manipulação gênica

Manipulação gênica

Propriedades intrínsecas dos ácidos nucléicos:
- Capacidade de replicação;
É necessário:

- Interações com proteínas;

- Separar os ácidos nucléicos dos demais constituintes celulares;

Endonucleases de restrição;

- Detectar a presença dos ácidos nucléicos.
Seleção de genes específicos e aumento da sua quantidade seja
por:
- Clonagem
-Amplificação

Extração de ácidos nucléicos

Isolamento de ácidos nucléicos
Objetivos:

Pontos fundamentais:

Métodos:

Remoção de proteínas

Solubilidade diferencial;

DNA vs. RNA

Métodos de adsorção;

Isolamento de um tipo específico

Centrifugação em gradiente;

de molécula.

1. As células (ou capsídeos, no caso de vírus de DNA) devem ser
rompidas para liberar seu conteúdo;2. O extrato celular dever ser tratado para remoção de
componentes
3. Os ácidos nucléicos são concentrados por precipitação.

Características gerais:
Tipos de DNA:

Lise celular desnaturante

Genômico ( cromossomal)

(SDS, álcali, fervura)

Organelar ( mitocondrial)

• Tratamento enzimático:

Plasmídeo (extra-cromossomal)

-Protease

Fago/Viral (ds ou ss)

-RNAse(DNAse-free)

Complementar (cDNA)

-DNAse (RNAse-free)

Extração de ácidos nucléicos

Rompimento mecânico de tecidos e células.

1. Lise celular:
Métodos químicos
membrana celular:

para

rompimento

de

parede

celular/

- enzimas (por exemplo, proteinase K e lisozima)
- detergentes (por exemplo, Triton X-100 e SDS)
Pulverização

Homogeneização

Moagem com micro-esferas devidro

2

26/08/2014

2. Remoção de proteínas e lipídeos com solventes
orgânicos:

3. Precipitação dos ácidos nucléicos com álcool (etanol ou
isopropanol):

Extração com Fenol

Fase aquosa
(DNA + RNA)
Interface
(proteínas coaguladas)
Fase Fenólica
(proteínas)

Extração de RNA

1. 2 – 2,5 volumes de EtOH,-20ºC
2. Alto sal, pH 5 – 5,5
3. Centrifugar ou coletar com bastão...
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