Biologia molecular

Metodologia
(Extração de DNA Cromossomal de Bactérias)

Método: Fenol-Clorofórmio
Colocou-se células em 3ml de meio LB sob agitação por 16 horas. Retirou-se deste crescido 2x 1,5ml (3ml em microtubos diferentes) de bactérias e coletou-se a partir de centrifugação a 14000 rpm por 2 minutos a temperatura ambiente (T.A) , sendo o sobrenadante (meio de cultivo) descartado. Foi ressuspendido o sedimento (pellet) em 1ml de tampão TE (NaCl 100mM; EDTA 50 mM e Tris-HCl 50mM pH 8,0) e centrifugou-se por 2 minutos a 14000 rpm e descartou-se o sobrenadante. Ressuspendeu-se o pellet em 300 microlitros de TE e adicionou-se 2 microlitvoros de RNAse (10 mg ∕ml) e incubou-se por 10 minutos a TA. Não adicionou-se 30 microlitros de Lisozima (20mg∕ ml). Adicionou-se 50 microlitros de Triton X-100 10% e 3 microlitros de NaCl 3M e aqueceu-se a 60°C por 5 minutos, em seguida resfriou-se vagarosamente a TA. Adicionou-se 0,1 volume de SDS 10% e homogeneizou-se bem. Adicionou-se 30 microlitros de proteinase K (10mg∕ ml) e incubou-se por 15 minutos a 37°C. Adicionou-se 1 volume de Fenol e agitou-se por 5 minutos no vortex. Em seguida centrifugou-se a 14000 rpm por 2 minutos a TA e recuperou-se a fase aquosa. Adicionou-se à fase aquosa 1 volume de clorofane (fenol-clorofórmio). Adicionou-se 1 volume de Fenol e agitou-se por 5 minutos no vortex. Em seguida centrifugou-se a 14000 rpm por 2 minutos a TA e recuperou-se a fase aquosa. Adicionou-se à fase aquosa 1 volume de Clorofórmio. Adicionou-se 1 volume de Fenol e agitou-se por 5 minutos no vortex. Em seguida centrifugou-se a 14000 rpm por 2 minutos a TA e recuperou-se a fase aquosa. Recuperou-se a fase aquosa final e adicionou-se o,1 volume de NaCl 3M e vagarosamente 2,5 volume de Etanol 100% a -20°C. Centrifugou-se a 14000 rpm por 2 minutos e retirou-se o etanol invertendo rapidamente microtubo no papel toalha. Deixou-se secar em fluxo laminar. E finalmente eluiu-se o pellet em 50 microlitros de água deionizada autoclavada e