Biologia molecular

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Metodologia
(Extração de DNA Cromossomal de Bactérias)

Método: Fenol-Clorofórmio
Colocou-se células em 3ml de meio LB sob agitação por 16 horas. Retirou-se deste crescido 2x 1,5ml (3ml em microtubos diferentes) de bactérias e coletou-se a partir de centrifugação a 14000 rpm por 2 minutos a temperatura ambiente (T.A) , sendo o sobrenadante (meio de cultivo) descartado. Foi ressuspendido osedimento (pellet) em 1ml de tampão TE (NaCl 100mM; EDTA 50 mM e Tris-HCl 50mM pH 8,0) e centrifugou-se por 2 minutos a 14000 rpm e descartou-se o sobrenadante. Ressuspendeu-se o pellet em 300 microlitros de TE e adicionou-se 2 microlitvoros de RNAse (10 mg ∕ml) e incubou-se por 10 minutos a TA. Não adicionou-se 30 microlitros de Lisozima (20mg∕ ml). Adicionou-se 50 microlitros de Triton X-100 10%e 3 microlitros de NaCl 3M e aqueceu-se a 60°C por 5 minutos, em seguida resfriou-se vagarosamente a TA. Adicionou-se 0,1 volume de SDS 10% e homogeneizou-se bem. Adicionou-se 30 microlitros de proteinase K (10mg∕ ml) e incubou-se por 15 minutos a 37°C. Adicionou-se 1 volume de Fenol e agitou-se por 5 minutos no vortex. Em seguida centrifugou-se a 14000 rpm por 2 minutos a TA e recuperou-se afase aquosa. Adicionou-se à fase aquosa 1 volume de clorofane (fenol-clorofórmio). Adicionou-se 1 volume de Fenol e agitou-se por 5 minutos no vortex. Em seguida centrifugou-se a 14000 rpm por 2 minutos a TA e recuperou-se a fase aquosa. Adicionou-se à fase aquosa 1 volume de Clorofórmio. Adicionou-se 1 volume de Fenol e agitou-se por 5 minutos no vortex. Em seguida centrifugou-se a 14000 rpm por 2minutos a TA e recuperou-se a fase aquosa. Recuperou-se a fase aquosa final e adicionou-se o,1 volume de NaCl 3M e vagarosamente 2,5 volume de Etanol 100% a -20°C. Centrifugou-se a 14000 rpm por 2 minutos e retirou-se o etanol invertendo rapidamente microtubo no papel toalha. Deixou-se secar em fluxo laminar. E finalmente eluiu-se o pellet em 50 microlitros de água deionizada autoclavada eestocou-se à -20 °C até a quantificação do DNA por Espectrofotometria.
Resultado: A foto que comprovava a extração do DNA foi perdida por causa do computador. Porém, todos os grupos conseguiram extrair o DNA somente na segunda tentativa.




Metodologia
(Preparação de um gel de agarose para análise de DNA)
O primeiro passo para é o preparo da placa de gel, para isso realiza-se os seguintespassos:
a) Montar uma placa de eletroforese, limitando-a em toda a extensão com fita crepe. Certificando-se de que houve uma boa vedação
b) Colocar a solução de agarose-tampão-TBE 1X, para fechar uma concentração do gel de 0,8%. Não é necessário mexer o elermeyer para homogeneizar pois pode formar bolhas.
c) Fundir a solução em micro-ondas
d) Deixar a temperatura abaixar até cerca de 50 graus eadicionar o volume apropriado brometo de etideo para obter uma concentração final de 0,5µg por mL.
e) Verter o conteúdo do Becker no molde de gel
f) Colocar rapidamente o pente sobre a placa, centrando-o suspenso.
g) Deixar gelificar à temperatura ambiente por 30-40 min. Retirar o pente.
Eletroforese:
h) Transferir o gel para a cuba de eletroforese, verter a quantidade de TBE 1X necessária paracobrir completamente o gel.
i) Conectar os cabos entre a fonte de tensão e a cuba, de maneira que a corrida ocorra do polo negativo para o positivo.
j) Aplicar as preparações de DNA, previamente misturadas ao tampão de amostra, com o auxílio de uma micro pipeta automática.
k) Aplicar voltagem de 1-5Vcm
l) Acompanhar a corrida usando como referência o corante azul do tampão de amostra TBE 5X.(imagem anexo 1)
m) Desligar a fonte de tensão e remover o gel da cuba.

Resultados Obtidos:
O gel e a cuba de eletroforese foram preparadas pelas monitoras da disciplina, após revelar em câmara UV, pode-se observar que todas as equipes conseguiram de fato, extrair DNA, infelizmente, por problemas no computador, perdemos as fotos da revelação do gel.




(Anexo 1) Imagem da corrida da...
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