Biologia molecular

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PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DE MINAS GERAIS
Instituto de Ciências Biológicas e da Saúde
Curso de Ciências Biológicas





BIOLOGIA MOLECULAR
Relatórios de Aulas Práticas
Clonagem















Belo Horizonte

2009

RELATÓRIOS DAS PRATICAS 10, 11, 12,13.

TÍTULO: Clonagem – Visualização prática

OBJETIVO
Através da prática, conhecerexperimentalmente a técnica de clonagem, que diferentemente da técnica de PCR, a amplificação in vivo não é uma reação enzimática. Conhecer as etapas envolvidas, seus constituintes, o princípio e a importância desse método utilizado na Biologia Molecular.

INTRODUÇÃO
Nas últimas décadas, com o desenvolvimento da Biologia Molecular e das demais áreas afins, uma imensa variedade de avanços tecnológicosfoi conquistada, graças à atividade de pesquisa de diversos grupos em todo o mundo. Os avanços se deram principalmente, no sentido de se isolar, alterar e reintroduzir, em laboratório o material genético, para depois ser reitroduzido em microrganismos, sendo a essência dessa tecnologia a possibilidade de gerar espécies melhoradas ou novas (LEWIN, 1994).
Assim foi possível a realização daclonagem, ou seja, a produção de células ou de moléculas de DNA idênticas, in vitro, a a partir de um único ancestral. Os clones seriam, então,as cópias deste modelo.
Segundo FAHEL (2006) a técnica de clonagem é útil para construção de bibliotecas de gens e expressão de proteínas. Para tal é inserido em um vetor, como plasmídeos, um fragmento do DNA que se quer estudar. Alguns vetores têm seuDNA modificado para otimizar a inserção de moléculas de DNA e facilitar a seleção de colônias bacterianas que contém o plasmídeo com o fragmento de DNA desejado.
O conceito básico de clonagem posicional compreende a identificação inicial da localização cromossômica, onde se suspeita residir o gene associado a um dado fenótipo. Os passos subseqüentes envolvem a redução da área crítica aomenor tamanho possível e por fim a identificação do gene-alvo .



Ligação
A ligação de um fragmento de DNA linear a um plasmídeo linearizado envolve a formação de novas ligações fosfodiéster entre o resíduo de fosfato localizado no terminal 5’ da fita dupla de uma das moléculas do DNA e a hidroxila do terminal 3’ da outra molécula. A enzima que cataliza essa ligação é denominada DNA ligase.A DNA ligase é ativada pela adenilação de um resíduo de lisina no seu sítio ativo, que por sua vez adenila o grupamento fosfato no terminal 5’ do DNA, tornando-o ativado. Esse grupamento ativado sofre um ataque nucleofílico da hidroxila do terminal 3’, ocorrendo a formação de uma ligação fosfodiéster, liberando AMP. Todos os organismos possuem DNA ligases que estão envolvidas no processo dereplicação do DNA celular. As DNAs ligases de E.coli e do fago T4 são muito utilizadas em ensaios de biologia molecular e diferem principalmente em termos do cofator necessário para sua ativação. A DNA ligase isolada de E.coli e de outras bactérias requer NAD+, enquanto que a isolada do bacteriófago T4 requer ATP para sua ativação.
(...)Para a ligação de fragmentos de PCR, um método comum é incluirsítios para enzimas de restrição nas sequências dos oligos utilizados para a amplificação, gerando fragmentos amplificados que contém esses sítios em suas extremidades. Após a amplificação o DNA é clivado com as enzimas em questão e ligado ao plasmídeo linearizado. Uma característica peculiar da Taq DNA polimerase é a adição de uma ou duas adeninas extras ao terminal 3’ da fita dupla de DNA, deuma maneira independente de DNA molde. Para facilitar a clonagem de produtos de PCR, foram desenvolvidos vetores de clonagem que possuem dois resíduos de timina no terminal 3’, que paream com as duas adeninas do fragmento de PCR, facilitando a reação de ligação.
O objetivo dessa reação é a ligação do fragmento de DNA ao vetor digerido. A reação de ligação permitirá subclonar o fragmento de...
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