assim como se foi

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sequencia de bases em aminoácidos:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ -> blast -> blastx -> botão blast pra traduzir
ai depois de uma eternidade, vc clica naprimeira barra em vermelho, depois em 'sequence ID' depois em 'fasta'

joga essa sequencia em http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/ -> submit -> lá em baixo vaiter a quantidade de aminoácidos que vc vai tirar que é o peptidio sinal, ai vc multiplica por 3 e tira essa quantidade de bases.
com esse resultado vc fazseu primer, primeiro vc pega as 30 ultimas bases e joga no http://bioinformatics.org/sms/rev_comp.html a sequencia ja vai estar no complement 5' - 3' ai vc jogaessa sequencia e a sequencia das 30 primeiras bases no http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome pra ver se alinhou,normalmente sim, é meio desnecessário essa etapa, ai vc vai com essas mesmas duas sequencias em joga cada uma numa pagina dohttp://www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/ . Ai vc vai determinar a Tm, a sequencia com maior tm vc vai tirando base da direita pra esquerda ate ficar proxima da sequencia com menortm.

ai vc tem que determinar o sitio que vc vai usar do vetor, pra isso vc joga a sua proteina sem o peptidio sinal no nebcutter e lá vai aparecer os sitiosque a proteina tem, ai vc ve a que tem no seu vetor e que nao tem na proteina e escolhe esse, um pra cada primer, ai vc joga esses que vc escolheu no site dabiolabs e ve a sequencia dele e incorpora no seus primers. Pronto, agora tem q responder as questoes, que tmb precisa de uns sites, mas nao fiz ainda.
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